PCR merupakan singkatan dari Polymerase Chain Reaction, sebuah teknik biologi molekuler untuk memperbanyak salinan suatu daerah rantai DNA yang spesifik. Biasanya DNA ini merupakan yang ingin diteliti atau diketahui oleh pelaku eksperimen. Contohnya seperti peneliti ingin mengetahui fungsi dari sebuah gen, atau seorang peneliti forensik ingin menggunakan penanda genetik untuk mencocokkan dengan DNA target pelaku kriminal. Goal dari proses PCR ini adalah untuk mencukupkan DNA target tertentu agar dapat dilihat dan dianalisis oleh peneliti. Karena seperti yang kita tahu, DNA merupakan nukleotida yang berukuran sangat kecil dan tidak dapat dilihat oleh kasat mata. Untuk mengetahui bagaimana Prinsip Kerja PCR, simak lebih lanjut di bawah ini.
Nah, bagaimana Prinsip kerjanya?
Apakah kamu tahu bahwa prinsip kerja Polymerase Chain Reaction PCR mencontoh bagaimana DNA di dalam tubuh manusia dapat diperbanyak? Ternyata DNA di dalam tubuh kita juga diperbanyak, lho, fenomena ini dikenal dengan sebutan replikasi DNA. karena setiap sel di tubuh manusia harus terus diperbaharui dan terus tumbuh dan berkembang sesuai pertambahan usia. Maka dari itu, DNA di dalam tubuh juga harus ikut diperbanyak karena setiap sel tubuh kita membutuhkan unit DNA.
Seperti dalam proses replikasi DNA pada organisme hidup, teknik PCR juga membutuhkan sebuah Enzim DNA polymerase yang bertugas untuk membuat kopian strand DNA baru dengan menggunakan stand DNA yang sudah ada sebagai template. DNA polimerase yang biasanya digunakan pada teknik proses PCR disebut dengan Taq polymerase, yaitu enzim DNA polimerase stabil yang berhasil diisolasi dari bakteri termofilik ekstrem Thermus aquaticus yang hidup pada dinding geyser vulkanik. Sifatnya yang thermostabil membuat Taq polymerase ideal untuk digunakan pada tahap pemisahan (denaturasi) template DNA.
Baca Juga : Fungsi Aplikasi PCR Selain Diagnosa Penyakit
Selain Taq polymerase, adanya Primer juga dibutuhkan, sekuen nukleotida pendek yang dapat menginisiasi starting point dari sintesis DNA. Dalam reaksi berantai (Polimerase Chain Reaction) PCR, pelaku eksperimen sudah menentukan sebelumnya daerah DNA mana yang akan dikopi dan diamplifikasi dengan memilih urutan primer mana yang akan digunakan. Primer PCR berupa single stranded DNA dan panjangnya berukuran sekitar 20 nukleotida. Pada prinsip kerja PCR, digunakan sebanyak 2 primer yang didesain mengapit daerah DNA yang ingin diperbanyak.
Setelah primer berikatan dengan DNA templat, untai tunggal DNA akan diperpanjang oleh enzim DNA polimerase dan daerah yang diapit akan terkopi.
Cara Kerja PCR
Kunci dalam pelaksanaan reaksi PCR membutuhkan Taq Polymerase, Primer, DNA templat dan nukleotida (blok pembangun DNA). Keseluruhan bahan digabung dalam sebuah tube, bersama kofaktor yang dibutuhkan oleh enzim, dan melewati siklus pemanasan dan pendingan berulang yang memungkinkan terjadinya amplifikasi DNA.
Langkah kerja PCR melewati 3 tahap berikut:
- Denaturation / denaturasi (96°C): Pada proses denaturasi, panas mempengaruhi strand DNA akan terpisah menjadi DNA beruntai tunggal (single-stranded).
- Annealing / penempelan (55-65°C): Pada tahap penempelan ini, suhu annealing primer akan menempel dan berikatan pada daerah komplementer pada sekuen single-stranded DNA.
- Extension / elongasi (72°C): Pada suhu ini Taq polymerase melakukan pemanjangan membentuk strand DNA baru.
Siklus ini berulang 25-35 kali dalam reaksi PCR, dimana membutuhkan waktu sekitar 2-4 jam bergantung pada Panjang DNA yang ingin dikopi. Jika reaksinya efisien, wilayah target dapat berubah dari hanya satu atau beberapa salinan menjadi milyaran. Karena ada banyak salinan atau untai ganda primer dan banyak molekul Taq polymerase yang mengambang di sekitar reaksi, sehingga jumlah molekul DNA kira-kira bisa berlipat ganda dalam setiap putaran siklus. Pola pertumbuhan eksponensial ini ditunjukkan pada gambar di bawah ini.
Hasil dari reaksi PCR dapat divisualisasi menggunakan Gel Electrophoresis. Prinsip dari gel electrophoresis yaitu pemanfaatan kutub positif dan negatif elektroda untuk menarik fragmen DNA didalam matriks gel berarus listrik sehingga fragmen DNA terpisah berdasarkan ukurannya. Sebagai standar digunakan DNA ladder untuk mengukur ukuran suatu fragment DNA hasil PCR. Fragmen DNA dengan panjang yang sama membentuk ‘pita’ pada gel, yang dapat dilihat dengan mat ajika gel diwarnai dengan pewarna pengikat DNA. Sebagai contoh, reaksi PCR yang menghasilkan fragmen 400 base pair (bp) terlihat seperti pada gel.
Polymerase Chain Reaction PCR berkerja dengan visualisasi menggunakan gel elektroforesis menggunakan mesin PCR konvensional. Dengan teknik ini, hasil PCR hanya dapat dilihat diakhir setelah proses selesai menggunakan gel elektroforesis (kualitatif) dan tidak dapat dikuantifikasi. Dengan perkembangan teknologi, kini hasil PCR dapat dilihat secara langsung dan dapat terkuantifikasi menggunakan mesin Real-time PCR. Real-time PCR disebut juga dengan quantitative PCR (qPCR) karena hasil PCR dapat analisis secara kuantitatif.
Bagaimana prinsip kerja Real-time PCR?
Prinsip kerja real-time PCR (qPCR) sama dengan PCR konvensional. Namun untuk melihat proses amplifikasi secara nyata ‘real-time’, perlu penambahan probe fluorescence (penanda) pada target sampel PCR sehingga cahaya fluorescence dapat tertangkap oleh detektor yang terdapat pada mesin real-time PCR. Oleh karena itu, jika jumlah salinan gen meningkat selama reaksi, fluoresensi juga akan meningkat yang mana menunjukkan kemajuan pada reaksi PCR. Hasil reaksi PCR menggunakan mesin real-time PCR, dilihat berupa kurva eksponensial pada software komputer dimana kurva Y menunjukkan jumlah cahaya fluorescence yang tertangkap, sedangkan kurva X menunjukkan jumlah siklus PCR yang berlangsung.
Bagaimana untuk sampel RNA?
RNA adalah materi genetik nukleotida beruntai tunggal (single-stranded RNA), sehingga untuk dapat memenuhi proses 1 denaturasi di mesin PCR, RNA perlu dikondisikan menjadi RNA beruntai ganda yang disebut complementary DNA (cDNA). Proses pembuatan cDNA dari RNA memerlukan sebuah enzim yang bernama Reverse Transcriptase. Dalam pengerjaannya enzim Reverse Transcriptase ditambahkan kedalam tube bersama bahan PCR lainnya. Proses pengerjaan PCR yang menggunakan sampel RNA ini disebut juga dengan Reverse Transcription PCR (RT-PCR). Namun saat ini jarang sekali peneliti melakukan pengerjaan sampel RNA menggunakan mesin PCR konvensional. Umumnya peneliti RNA menggunakan mesin real-time PCR untuk mengamplifikasi sampel RNA, karena waktu yang dibutuhkan lebih singkat karena proses reverse transcription dan amplifikasi dapat dilaksanakan dalam satu rangkaian sekaligus. Selain itu penggunaan mesin real-time memungkinkan hasil amplifikasi terlihat secara langsung dan dapat terkuantifikasi. Proses amplifikasi RNA menggunakan mesin real-time PCR disebut juga dengan RT-qPCR.
Genecraft Labs sebagai salah satu distributor alat laboratorium, bioteknologi terbesar dan terpercaya di Indonesia memiliki beberapa pilihan instrumen mesin PCR yang dapat memenuhi kebutuhan penelitian anda, antara lain:
Mesin PCR konvensional:
- SENSOQUEST Labcycler 48 – Gradient Thermocycler (PCR)
- SENSOQUEST Labcycler Thermocycler
Mesin Real-time PCR:
