“Bagai mencari jarum dalam tumpukan jerami’ adalah istilah yang sering kita dengar namun ternyata juga dapat berlaku dalam penelitian di bidang biologi molekular yang melibatkan aplikasi-aplikasi yang butuh sensitivitas tinggi. Pencarian Copy Number Variation (CNV), variant biomarker atau alel penyebab mutasi yang jarang/ langka seringkali menimbulkan kesulitan bagi para peneliti dikarenakan sinyal positif yang lemah dan hampir tidak terdeteksi di antara kumpulan sinyal negative (misal 1 sinyal positif di antara 100.000 sinyal negative) dan kuatnya sinyal background. Situasi seperti ini tentu butuh Teknik PCR yang lebih sensitif dan akurat daripada teknik standar Real Time PCR (qPCR) yang kita sudah kenal pada prinsip kerja PCR.
Perkembangan teknologi PCR generasi generasi ketiga menggunakan partisi satu sampel PCR menjadi banyak reaksi individu (ibaratnya daripada 100.000 molekul dianalisis bersamaan lebih baik dibagi-bagi menjadi reaksi yang lebih kecil sehingga sinyalnya lebih mudah untuk dianalisis). Dengan demikian aplikasi-aplikasi yang tadinya sulit sekarang dapat dilakukan dengan lebih baik tanpa mengorbankan hasil. Ketahui juga bagaimana Sejarah Mesin PCR Berevolusi.
Dikutip dari situs Sciencemag, konsep PCR digital (dPCR) untuk deteksi dan kuantifikasi asam nukleat bukanlah hal baru. Pada tahun 1992, Sykes et al. menggambarkan metode di mana mereka mengukur jumlah target DNA awal dalam sampel bukan produk hasil amplifikasi PCR [1]. Dengan menggunakan pengenceran terbatas, PCR, dan distribusi Poisson, ini membantu mereka menghitung jumlah absolut sel leukemia dalam sampel mereka. Beberapa tahun kemudian, pada tahun 1999, istilah digital PCR atau dPCR digunakan untuk menggambarkan metode yang diperkenalkan oleh Vogelstein dan Kinzler di mana sampel dipartisi dan diamplifikasi sehingga produk PCR yang dihasilkan benar-benar adalah mutan atau benar-benar wild type [2]. Mengakui limitasi PCR dalam deteksi dan verifikasi mutasi tingkat rendah, penulis menguji kelayakan metode mereka menggunakan sampel tinja/stool dari pasien penderita kanker kolorektal untuk mendeteksi onkogen (gen penyebab kanker) KRAS mutan. Mereka membuktikan bahwa dPCR dapat digunakan untuk mendeteksi mutasi yang ada pada tingkat yang relatif rendah.
Gambar 1 Milestone pengembangan digital PCR hingga produk dPCR terbaru keluaran QIAGEN
Kekuatan Digital PCR
Digital PCR adalah pendekatan yang sangat tepat untuk deteksi dan kuantifikasi asam nukleat yang sensitif dan reproducible. Pengukuran dilakukan dengan membagi sampel menjadi beberapa partisi, sehingga terdapat nol atau satu molekul target dalam setiap reaksi. Setiap partisi dianalisis setelah siklus PCR endpoint untuk mengetahui ada atau tidaknya sinyal fluoresen (1 atau 0), dan jumlah absolut molekul yang ada dalam sampel dihitung. Digital PCR tidak bergantung pada kurva standar untuk kuantifikasi target sampel. Menghilangkan ketergantungan pada kurva standar akan mengurangi kesalahan dan meningkatkan presisi. Distribusi Poisson memungkinkan dPCR untuk penghitungan yang akurat dari molekul target [3]. Presisi dPCR akan meningkat dengan bertambahnya jumlah partisi. Berangkat dari kebutuhan akan digital PCR yang mudah digunakan, dapat diandalkan, dan presisi, QIAGEN menciptakan QIAcuity, digital PCR yang juga merupakan produk terbarunya yang bisa Anda dapatkan di GeneCraft Labs distributor alat laboratorium resmi dan terlengkap di Indonesia.
Gambar 2 Langkah-langkah pengerjaan sampel menggunakan digital PCR
QIAcuity memiliki metode yang serupa qPCR dalam hal cara kerja dan reaksi amplifikasinya sehingga memudahkan pengguna yang sudah terbiasa menggunakan qPCR. Sistem QIAcuity dikembangkan sebagai teknologi berbasis nanoplate, yang menawarkan manfaat yang signifikan dibandingkan teknologi droplet digital PCR (ddPCR). Partisi tetap yang diintegrasikan ke dalam dPCR nanoplate mencegah variasi dalam ukuran dan penggabungan seperti yang terlihat dalam metode ddPCR. Selain itu, pembacaan simultan dari semua partisi hasil sampel memberikan pembacaan yang lebih cepat. Nanoplates tidak hanya ramah pengguna dan mudah dipipet seperti qPCR, tetapi juga dapat digunakan untuk otomatisasi front-end.
Proses partisi, thermocycling, imaging, dan analisis semuanya terintegrasi ke dalam satu instrumen yang sepenuhnya otomatis, memberikan hasil dalam waktu < 2 jam vs > 4 empat jam untuk sistem digital PCR digital yang tersedia saat ini di pasaran.
qPCR | dPCR QIAcuity | |
| Ketergantungan terhadap Kurva Standar | Ya; relative quantification | Tidak; absolute quantification |
| Presisi | Rendah; mendeteksi mutasi pada tingkat >1% | Tinggi; mendeteksi mutase pada tingkat ≥0.001% Meningkatkan rasio signal-to-noise |
| Efisiensi Amplifikasi | Bervariasi; kuantifikasi berdasarkan analisis sinyal fluoresens pada fase eksponensial, rentan terhadap inhibitor | Tidak terpengaruh; proses partisi dan pengukuran sinyal fluoresens endpoint pada partisi individual |
| Toleransi Inhibitor | Rendah | Tinggi; volume partisi yang kecil berkontribusi pada ketahanan terhadap banyak variasi inhibtior |
| Reliability dan reproducibility | Rendah; dibutuhkan control atau referensi | Tinggi; tidak membutuhkan referensi atau kalibrasi |
Aplikasi yang Direkomendasikan dengan Digital PCR
Gambar 3 Lima Aplikasi yang paling banyak digunakan pada digital PCR
Aplikasi seperti rare mutation detection, copy number variation, NGS library quantification, low-level pathogen detection, viral load detection, dan deteksi GMO dapat meningkat sejalan dengan tingkat presisi dan sensitivitas yang ditawarkan digital PCR yang tidak dimiliki qPCR. Di kalangan peneliti dPCR dapat melengkapi metode yang selama ini sudah digunakan di qPCR bukan untuk menggantikan.
PT. Genecraft Labs merupakan distributor resmi alat laboratorium di Indonesia yang menyediakan solusi berbagai macam produk dan layanan untuk kebutuhan laboratorium, penelitian, pendidikan, kontrol kualitas, dan pengujian lapangan Anda seperti reagen, alat PCR, Life Science Instrument, General Lab Instruments, ataupun Analytical Chemistry Instruments. Jangan khawatir jika anda membutuhkan konsultasi sebelum melakukan pembelian anda dapat menghubungi sales kami di sales@genecraftlabs.com dan tim kami akan segera melayani anda.
Referensi:
[1] Sykes PJ, Neoh SH, Brisco MJ, Hughes E, Condon J, Morley AA. “Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution,” Biotechniques 13 (3), 444-9(1992). [PMID: 1389177]
[2] Vogelstein B, Kinzler KW. Digital PCR. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (16), 9236-41 (1999). [PMID: 10430926]
[3] Morley, A.A. Digital PCR: A brief history. Biomol. Detect. Quantif. 2014, 1, 1–2. [Google Scholar] [CrossRef]
