Sejarah Mesin PCR yang Senantiasa Berevolusi

Sejarah PCR atau Polymerase Chain Reaction pertama kali ditemukan oleh Kary Banks Mullis. Dalam 37 tahun sejak penemuan, PCR telah menjadi teknik standar dalam biologi laboratorium yang terus dikembangkan oleh para ilmuwan untuk menemukan aplikasi yang merupakan terobosan baru dan inovatif dalam menunjang kehidupan manusia. Sejarah PCR berawal dari PCR — amplifikasi enzimatis dari fragmen DNA spesifik yang merupakan ditargetkan oleh dua primer oligonukleotida adalah konsep yang sangat sederhana namun merupakan teknologi dasar yang kuat dan diterapkan secara luas. Dimulai dengan template DNA atau RNA, siklus berulang dari denaturasi, penempelan primer, dan pemanjangan primer oleh mediasi enzim polimerase menghasilkan akumulasi eksponensial dari fragmen target spesifik yang dapat dianalisis dengan berbagai metode. Saat ini sulit rasanya untuk memahami studi berbasis asam nukleat yang tidak memasukkan Mesin PCR di dalam tahapan protokol eksperimennya.

Tidak banyak penemuan dalam kurun waktu 100 tahun terakhir yang dapat menyaingi pentingnya peran dari sejarah Polymerase Chain Reaction dalam dunia riset biologi dan genetic. Polymerase Chain Reaction atau PCR telah menjadi salah satu teknik paling berharga yang saat ini digunakan dalam ilmu biologi, diagnostik, dan forensik. Dilihat dari sejarah bagaimana mesin PCR berkembang selama ini, mesin PCR telah direplikasi, diperkuat, dan diperluas ke ranah laboratorium di seluruh dunia. Thermalcyclers khusus dan alat penunjangnya membanjiri pasar, vendor menjual berbagai pilihan enzyme DNA polymerase yang termostabil, dan sarjana sains di seluruh dunia wajib mempelajari teknik ini dalam kursus pengantar biologi di universitas. Dalam artikel ini akan dibahas sejarah perkembangan teknologi mesin PCR dari masa-masa awal hingga yang terkini serta potensi pengembangannya di masa depan.

Baca Juga: Fungsi Aplikasi PCR Selain Diagnosa Penyakit

Sejarah Pengembangan Awal PCR

Komponen hardware utama Polymerase Chain Reaction adalah thermal cycler, mesin yang mampu memanaskan dan mendinginkan tube sampel dengan cepat dan menjaganya pada suhu spesifik untuk periode waktu tertentu. Meskipun tiga dekade pengembangan dan kompetisi telah terjadi peningkatran terhadap alat ini tapi mereka masih relatif berat, haus daya, dan mahal. Akibatnya teknik yang sangat menentukan di bidang biologi molekuler modern tetap tidak dapat diakses oleh beberapa periset dan tidak dapat digunakan di banyak lokasi terpencil.

“PCR adalah salah satu teknologi [penelitian] yang paling penting, namun itu juga salah satu yang paling membatasi saat Anda berada di luar lab karena ukuran dan biaya peralatan”, kata Zeke Alvarez-Saavedra, ahli genetika dan salah satu pendiri dari MiniPCR di Cambridge, Massachusetts. Frustrasi oleh imobilitas PCR yang tidak ada solusinya, Alvarez-Saavedra bekerja sama dengan ahli saraf molekuler Sebastian Kraves pada tahun 2013 untuk membuat thermal cycler portabel.

Sebagian besar thermal cycler mengontrol suhu menggunakan Peltier junctions, perangkat termoelektrik yang dapat beralih dengan cepat antara pemanasan dan pendinginan. Sayangnya, Peltier junctions tidak efisien, dan komponen yang diperlukan untuk mengoperasikannya membuat mesin PCR tetap berat dan rakus akan listrik.

Alvarez-Saavedra dan Kraves mengambil pendekatan yang berbeda, memanaskan sampel dengan pemanas resistif film tipis yang mirip dengan pembersih kaca jendela yang ditemukan di mobil. Untuk pendinginan, tim menggunakan kipas sederhana. Mikrokontroler menggerakkan siklus pemanasan, pendinginan, dan inkubasi. Desain yang lebih sederhana membuat alat berat ini jauh lebih kecil dan lebih ringan daripada thermal cycler biasa. Sistem MiniPCR berbiaya rendah sangat menarik untuk sekolah. Perlengkapan lengkap dengan thermal cycler MiniPCR, sistem gel, dan aksesori dijual dengan harga kurang dari USD 1.000, menjadikannya sesuai dengan anggaran di banyak sistem sekolah. Selain sekolah, para ilmuwan lapangan, peternak hewan, dan perusahaan makanan juga mengadopsi platform tersebut karena biayanya lebih murah ketimbang daripada mengirim sampel ke laboratorium jarak jauh.

Sejak 1993, mengikuti perkembangan metode dan kebutuhan untuk memonitor kinetik PCR secara real time teknik PCR menjadi sepenuhnya kuantitatif (qPCR). Penggabungan reverse transcription (RT) sebagai langkah pertama sebelum siklus termal memungkinkan penggunaan teknologi PCR (RT-PCR atau qRT-PCR) dalam studi RNA. Modifikasi teknik PCR dasar ini dengan cepat menjadi standar emas untuk kuantitatif analisis asam nukleat. Sampai sekarang, terdapat tiga sistem dasar: PCR endpoint, qPCR dan digital PCR (dPCR) yang lazim dikenal dengan generasi pertama, kedua, dan ketiga (Gambar 1A). Jika Anda sedang mencari mesin PCR endpoint, Genecraft Labs menyediakan berbagai instrumen laboratorium.

Contoh terkini dari teknik Polymerase Chain Reaction yang tersedia secara komersial: quantitative PCR, droplet-based digital PCR, crystal digital PCR (cdPCR), PCR, bridge PCR untuk next-generation sequencing and mRNA sequencing dari sel tunggal dengan microfluidics. (A) Perbandingan dari end-point PCR, qPCR dan ddPCR. (B) Prinsip kerja dari solid phase bridge DNA amplification. (C) beberapa Teknik pemisahan sampel. (D) Crystal droplet PCR – pembentukan kristal droplet (E) PCR dan droplet-based library generation untuk sekuensing RNA Sel tunggal.

Miniaturisasi PCR Untuk Menunjang Mobilitas

Penerapan sistem mikrofluida mmemungkinkan pengembangan perangkat Polymerase Chain Reaction yang sama sekali baru, seperti mini PCR dan fast PCR, ini dimungkinkan oleh para pemeliti yang menggunakan teknologi micromachine silicon. Sistem PCR miniatur memberikan portabilitas dan menghemat waktu.

Droplet-based system

Ada beberapa teknik yang membagi sampel menjadi droplet (Gambar 1C). Droplet, termasuk sel, dimuat ke dalam channel mikrofluida dan dipindahkan ke posisi yang berbeda di dalam chip, kemudian menjalani serangkaian prosedur seperti lisis sel, ekstraksi DNA dan pemurnian, PCR dan deteksi fluoresensi. Tetesan dengan DNA yang diekstraksi, dalam volume nanoliter, dipisahkan oleh cairan yang tidak bercampur, seperti mineral oil, membentuk emulsi. Kemudian siklus termal dilakukan dengan memanaskan emulsi dan kamera menangkap fluoresensi yang dihasilkan. Platform ini biasanya digunakan dalam studi sel tunggal, sering disebut ‘Single Cell PCR’.

Chip-based system

Berbagai struktur chip dibuat dengan teknologi mikromachine dengan well atau saluran mikrofluida menggunakan bahan seperti silikon, kaca atau polimer, biasanya polidimetilsiloksan atau polimetilmetakrilat. Sampel dimuat ke dalam sumur atau saluran untuk selanjutnya mengalami amplifikasi DNA dengan PCR.  

Sistem hybrid

Alternatif lain, master mix PCR disalurkan di tempat yang stasioner seperti kaca penutup hidrofobik / oleofobik dan ditutup oleh mineral oil, membentuk virtual reaction chamber menggunakan pemanas mikro berbentuk donat untuk melakukan proses thermalcycling dan menggunakan metode pendinginan pasif.

Pengembangan selanjutnya berbasis teknologi PCR yang sudah ada

Aplikasi mikrofluida ke dalam sistem parallel untuk POC (point of care) (A) Chip-based integrated real-time reverse transcription PCR platform untuk analisis immunomagnetic RNA eksosomal. (B) Droplet-based quantitative PCR untuk purifikasi MRNA dari sell tunggal dan analisis ekspresi gen. (C) Chip-based digital RT-PCR untuk pengukuran kuantitatif absolut dari mRNA pada single cells. (D) Droplet-based dPCR untuk miRNA quantitation assay. (E) Paper-based LAMP system yang terbuat dari polydimethylsiloxane untuk diagnostik molekularfor. (F) Forensic science, profil DNA pada chip. (G) BioFire, deteksi bakteria dan virus dengan menggunakan chip.

Digital PCR

Jika kita telusuri bagaimana sejarah mesin PCR. Banyak teknologi telah dikembangkan dari teknologi mesin PCR awal; salah satu contohnya adalah dPCR, yang didasarkan pada pemisahan sampel PCR menjadi ribuan, dalam beberapa kasus jutaan, sub-sampel dari aslinya untuk mendigitalkan kumpulan molekul DNA yang masing-masing memiliki satu atau tidak ada salinan subsampel. dPCR selalu berbasis mikrofluida dan berbasis droplet atau berbasis chip. dPCR mampu menentukan penghitungan absolut salinan DNA / RNA, menghindari penghitungan yang memakan waktu oleh qPCR berdasarkan kurva standar. dPCR juga memungkinkan multiplex PCR untuk memperkuat jumlah salinan sampel DNA baik untuk DNA yang berlimpah dan langka. Mesin Digital PCR juga tersedia di PT Genecraft Labs.

Droplet digital PCR (ddPCR)

Sampel melewati chip mikrofluida membentuk jenis aliran tersegmentasi, di mana sampel dipecah menjadi puluhan ribu droplet yang dipisahkan oleh cairan yang tidak bercampur, yaitu minyak mineral yang membentuk emulsi. Emulsi dikumpulkan dalam vial selanjutnya dilakukan PCR dan diolah dengan flow cytometer untuk menghitung jumlah droplet dengan reaksi PCR positif. Dibandingkan dengan qPCR, ddPCR memiliki keunggulan presisi yang lebih tinggi dan lebih rendah koefisien variasi dalam kuantifikasi absolut. Multiplexing PCR biasanya dilakukan dengan fluoresensi berbasis probe dengan warna eksitasi yang berbeda untuk setiap DNA / RNA. Ini juga digunakan untuk menghasilkan perpustakaan untuk sekuensing RNA sel tunggal (Gambar 1E).

Digital PCR berbasis chip (cdPCR)

Sampel dimasukkan ke dalam chip silikon dengan well yang dibuat dengan teknik micromachine. Kemudian thermalcycling dilakukan dan chip tersebut dicitrakan dengan mikroskop fluoresensi untuk menentukan jumlah sumur dengan hasil PCR positif. Multiplexing juga dapat dilakukan dengan cara yang sama seperti di ddPCR.

Amplifikasi Isothermal

qPCR dilakukan dengan siklus termal dan kecepatannya biasanya dibatasi oleh pendinginan sampel, yang melambat dengan peningkatan volume sampel. Penggunaan komersial PCR dibatasi selama beberapa tahun oleh perlindungan paten yang diberikan kepada Cetus Corporation (kemudian dijual ke Chiron Corporation; CA, AS). Peneliti mencoba mengatasi masalah yang berkaitan dengan pendinginan dan mem-bypass perlindungan paten dengan mencari metode amplifikasi asam nukleat yang baru. Amplifikasi isothermal dapat mengatasi masalah pendinginan karena tidak memerlukan proses pendinginan. Beberapa teknik dikembangkan dengan amplifikasi isotermal, seperti loop-mediated isothermal amplification (LAMP) dan amplifikasi polimerase rekombinase, yang saat ini populer.

Amplifikasi asam nukleat isotermal tidak memerlukan peningkatan suhu bertahap dan memiliki keunggulan desain perangkat yang lebih sederhana dengan konsumsi daya yang lebih rendah dibandingkan dengan fast PCR. LAMP mencapai spesifisitas tinggi dengan menggunakan hingga enam primer untuk mengidentifikasi hingga delapan urutan DNA target. Pengenalan teknik amplifikasi isotermal yang berbeda juga menciptakan pendekatan baru untuk visualisasi produk amplifikasi dan pemantauan reaksi kinetika independen dari aktivitas eksonuklease DNA polimerase yang digunakan dalam qPCR dengan probe TaqMan.

Tantangan Luar Biasa dari Mesin PCR

Terlepas dari potensi diagnostik PCR yang besar, keberhasilan setiap aplikasi praktisnya sangat bergantung pada kualitas sampel yang mengandung asam nukleat untuk amplifikasi. Spektrum inhibitor PCR yang berbeda mempersulit pekerjaan terhadap sampel, seperti hasil negatif palsu atau batas deteksi yang lebih tinggi. Prosedur yang mengarah ke pemurnian sampel dan pengembangan DNA polimerase yang resisten terhadap inhibisi telah dikembangkan. Telah didokumentasikan bahwa dPCR lebih resisten terhadap keberadaan inhibitor. Selain itu, amplifikasi PCR yang sukses dari sekuens DNA kaya GC merupakan tantangan yang lain. Miniaturisasi perangkat Polymerase Chain Reaction menyoroti tantangan yang harus diselesaikan secara pra-analisis untuk mencapai sensitivitas yang sebanding dengan mesin PCR yang sudah lebih dulu hadir dan terpercaya hasilnya.

Baca Juga : Teknologi PCR Pada Biologi Molekular

Perspektif Terhadap Masa Depan Sejarah Mesin PCR

Ada beberapa teknik, seperti NGS, di mana dalam sejarah PCR memainkan peran yang sangat diperlukan di masa mendatang. PCR akan memainkan peran yang luar biasa dalam teknik diagnostik molekuler di masa depan. Kita dapat membayangkan penggunaan mikrofluida melakukan analisis parallel terhadap beberapa sampel menggunakan sistem POC (point of care) genggam. Perangkat mikrofluida juga akan dapat melakukan RT-PCR untuk menganalisis imunomagnetik RNA eksosomal (Gambar 2A). qPCR berbasis droplet untuk pemurnian mRNA sel tunggal dan analisis ekspresi gen akan menjadi aplikasi besar lainnya dalam waktu dekat (Gambar 2B), serta uji kuantitasi miRNA (Gambar 2D) dan RT-PCR digital berbasis chip untuk kuantifikasi absolut mRNA dalam sel tunggal (Gambar 2C).

Diperkirakan bahwa sistem berbasis kertas untuk PCR atau LAMP akan memiliki permintaan tinggi untuk diagnostik molekuler (Gambar 2E).

Internet of Things (IoT) suatu saat akan mampu mengintegrasikan Polymerase Chain Reaction dengan perangkat elektronik lainnya seperti smartphone untuk menunjang mobilitas dan kemampuan diagnosa yang lebih cepat dan efektif. Sistem dPCR portabel dengan turn around time yang cepat akan hadir untuk menunjang penelitian diagnostik klinis, ilmu forensik dan lingkungan, menghindari transfer sampel yang memakan waktu ke fasilitas besar yang berisiko mengalami degradasi sampel. Kedepannya sudah dapat dibayangkan bahwa teknologi dan perkembangan dalam sejarah PCR akan memegang peranan penting untuk kemajuan ilmu pengetahuan lebih dari yang sudah ada sekarang.

Sumber:

PCR Past, Present, Future BioTechniques 69: 00–00 (October 2020) 10.2144/btn-2020-0057

Shao H, Chung J, Lee K et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nat. Commun. 6, 6999 (2015)

Neuzil P, Pipper J, Hsieh TM. Disposable real-time microPCR device: lab-on-a-chip at a low cost. Mol. Biosyst. 2(6–7), 292–298 (2006)

Hindson CM, Chevillet JR, Briggs HA et al. Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR. Nat. Methods 10, 1003 (2013).

Notomi T, Okayama H, Masubuchi H et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res. 28(12), E63 (2000)

Toldra A, Jauset-Rubio M, Andree KB et al. Detection and quantification of the toxic marine microalgae Karlodinium veneficum and Karlodinium armiger using recombinase polymerase amplification and enzyme-linked oligonucleotide assay. Anal. Chim. Acta 1039, 140–148 (2018)

Sidstedt M, R˚adstr¨om P, Hedman J. PCR inhibition in qPCR, dPCR and MPS – mechanisms and solutions. Anal. Bioanal. Chem. 412, 2009–2023 (2020)