Teknik PCR yang kita kenal sekarang dikonseptualisasikan dan dikembangkan pada 1980-an oleh Kary Mullis dan rekan-rekannya di Cetus Corporation. Isolasi dan pemurnian polimerase Taq termostabil menyebabkan otomatisasi teknik PCR yang awalnya lambat dan melelahkan, dan pengembangan thermalcycler Teknologi PCR yang dapat diprogram menjadikannya teknik yang banyak digunakan di berbagai ilmu terapan untuk PCR biologi molekular dan kimia.
Meskipun Mullis yang menemukan PCR, penerapannya yang berhasil di beberapa bidang merupakan hasil kerja keras para peneliti Cetus lainnya seperti Henry Erlich. Selain itu, terdapat tantangan terhadap paten PCR yang dipegang oleh Mullis berdasarkan penelitian awal yang dilakukan oleh Khorana et al. di tahun 1960-an dan 1970-an. Ketahui juga mengenai prinsip kerja PCR.
Mullis menerima Hadiah Nobel untuk penemuan terobosannya pada tahun 1993. Ia juga menerima bonus $ 10.000 dari perusahaan tempat ia bekerja,Cetus, yang kemudian menjual hak paten kepada Hoffmann La-Roche dengan harga $ 300.000.000.
Berkat kegunaannya yang luar biasa, saat ini PCR digunakan di berbagai bidang seperti ilmu forensik, studi lingkungan, teknologi pangan, Bilogi molekular dan kedokteran diagnostik. Kemajuan besar selama bertahun-tahun dalam pemahaman kita tentang genom manusia dan beberapa spesies lain tidak akan mungkin terjadi tanpa teknik luar biasa namun sederhana yang disebut PCR. Kunci keberhasilan PCR terletak pada fitur-fitur kunci yang senantiasa dikembangkan.
Fitur-Fitur PCR
Pada tahun 80-an, para peneliti menjajaki berbagai sistem amplifikasi sinyal atau probe untuk aplikasi dalam penelitian dan diagnostik. Di sisi lain, PCR, dengan siklus sekuensial sintesis oligonukleotida berbasis primer adalah sistem amplifikasi target yang mampu mengamplifikasi daerah genom yang tidak diketahui di antara situs penempelan primer. Walaupun informasi urutan diperlukan ketika mendesain primer tetapi beberapa ketidaksesuaian antara primer dan template DNA, terutama yang ada di ujung 5 ‘primer, dapat ditoleransi. Hasilnya, primer berdasarkan urutan genom dari satu spesies dapat digunakan untuk memperkuat gen homolog dari spesies terkait, atau primer dari satu gen dalam famili multigen dapat memperkuat gen terkait.
Selain itu, informasi urutan yang berharga, seperti situs restriksi untuk memfasilitasi kloning atau sekuens adaptor dan kode barcode untuk Next Generation Sequencing (NGS), dapat dimasukkan di ujung amplikon melalui toleransi mismatch di ujung 5 ‘ dari primer. Label juga bisa dimasukkan ke dalam amplikon menggunakan primer yang diberi label di ujung 5, memfasilitasi pembacaan di elektroforesis gel dan analisis hibridisasi probe. Kemampuan PCR untuk menghasilkan konsentrasi tinggi dari target DNA berlabel tertentu menciptakan perubahan paradigma dalam analisis hibridisasi probe oligonukleotida.
Evolusi Teknologi PCR – Taq Polymerase
Pengenalan enzim polimerase termostabil pertama di PCR (Taq polymerase, yang diisolasi dari Thermus aquaticus) menghilangkan kebutuhan untuk menambahkan enzim fresh setiap siklus, memungkinkan pengembangan instrumen thermalcycler sederhana untuk mengotomasi PCR. Dengan memungkinkan annealing primer dan ekstensi pada suhu tinggi, penggunaan enzim polimerase termostabil juga sangat meningkatkan spesifisitas amplifikasi target.
Sejak pengenalan Taq polymerase, banyak polimerase yang berbeda dari berbagai bakteri termofilik dan archaea hipertermofilik telah diisolasi, dikarakterisasi, dan digunakan dalam PCR. Beberapa telah meningkatkan aktivitas eksonuklease 3´ (proofreading) dan, dengan demikian, meningkatkan akurasinya. Adapula polymerase yang memiliki kemampuan untuk menggunakan RNA sebagai template.
Penemuan DNA polimerase yang dapat mensintesis untai cDNA dari template RNA memungkinkan tes PCR untuk ekspresi gen serta deteksi dan karakterisasi virus RNA. Polimerase lain telah “direkayasa” untuk sifat-sifat tertentu dengan memutasi situs fungsional tertentu sehingga dideoksiribonukleotida atau ribonukleotida dapat digabungkan selama langkah ekstensi primer.
Kekhususan PCR telah ditingkatkan lebih lanjut dengan polimerase yang dimodifikasi secara kimiawi (“hot start” PCR) yang tetap non aktif pada suhu yang lebih rendah dan hanya memperpanjang primer pada suhu tinggi. Metode alternatif lainnya ada yang dapat memastikan bahwa polimerase tidak aktif pada suhu yang lebih rendah adalah penggunaan “aptamers”, oligonukleotida kecil yang telah dipilih secara in vitro untuk mengikat dan menghambat polimerase tertentu tetapi yang dapat terbuka pada suhu yang lebih tinggi sehingga menyebabkan polimerase aktif. Polimerase yang ditingkatkan spesifisitasnya ini —bersama dengan primer yang telah dimodifikasi secara kimiawi pada ujung 3 ‘untuk mencegah ekstensi pada suhu yang lebih rendah — sangat penting dalam mencapai sensitivitas dan spesifisitas yang dibutuhkan oleh banyak aplikasi diagnostik klinis.
Pada Desember 1989, Taq Polymerase dinobatkan sebagai “Molecule of The Year” oleh jurnal Science. Jurnal Taq PCR kemudian menjadi publikasi yang paling banyak dikutip dalam biologi molekuler dan PCR menyumbang lebih dari 3% dari semua kutipan di PubMed.
Evolusi Teknologi PCR – Kemampuan Kuantifikasi
Langkah penting lainnya dalam evolusi PCR adalah pengembangan analisis kurva real-time PCR yang berdasarkan pemantauan akumulasi eksponensial produk PCR. Awalnya, intensitas fluoresensi yang dihasilkan oleh pewarna yang terikat pada amplikon DNA untai ganda diukur pada setiap siklus. Bentuk kurva pertumbuhan dan, khususnya, siklus di mana intensitas fluoresensi melewati ambang batas (Ct), mencerminkan jumlah template target dalam reaksi, memungkinkan pengembangan uji homogen kuantitatif. Dalam perkembangan selanjutnya instrumen real-time PCR menjadi pilihan metode analisis kuantitatif yang disukai. Anda dapat menemukan sistem qPCR yang tersedia di PT Genecraft Labs.
Belakangan ini, pengembangan PCR digital, sistem masif reaksi PCR secara parallel yang dapat mengidentifikasi satu atau nol molekul target telah membuat analisis PCR kuantitatif menjadi lebih tepat. Pemisahan reaksi parallel PCR dapat dicapai baik dengan perangkat mikrofluida (reaksi PCR individu dalam ruang individu) atau dengan sistem emulsi (reaksi PCR individu dalam mikrodroplet individu).
Berkat kerja keras dan inovasi yang dilakukan para peneliti pada pengembangan teknologi PCR, peningkatan dan variasi pada proses dalam PCR telah menghasilkan ratusan aplikasi berbasis PCR yang digunakan di berbagai bidang. Salah satu karakteristik khas PCR tidak diragukan lagi adalah keserbagunaannya yang luar biasa pada banyak situasi berbeda. PCR adalah alat yang memiliki kekuatan untuk menciptakan situasi baru untuk penggunaannya terutama bagi mereka terbiasa menggunakannya.
Baca juga: Memilih Harga PCR Terbaik
Saat ini, sebagian besar tes kuantitatif didasarkan pada analisis kuantitatif PCR real-time dengan probe TaqMan. Tes multipleks berbasis PCR untuk HIV, HCV, dan HBV juga digunakan secara luas di sebagian besar program skrining darah. Meskipun sebagian besar tes IVD berbasis PCR adalah untuk deteksi patogen pada penyakit menular, banyak tes PCR sekarang melibatkan target gen, seperti skrining gen pembawa cystic fibrosis, deteksi mutasi bawaan (misalnya, BRCA1 dan BRCA2), dan mutasi somatik pada tumor (misalnya KRAS)
Mungkin yang paling berpengaruh dari semua teknik yang dimungkinkan oleh PCR adalah sekuensing genom berskala besar, yang dengan sendirinya telah mengubah arena penelitian biologi molekular dan bioteknologi.
