Sampel asam nukleat mudah terkontaminasi molekul lain sewaktu proses. Ekstraksi dan elusi dalam proses pemurnian oleh bahan kimia dari aplikasi upstream mengakibatkan kontaminasi tersebut.
Metode pemurnian yang melibatkan ekstraksi fenol, pengendapan fenol atau penggaraman tidak dapat sepenuhnya menghilangkan seluruh kontaminan atau bahan kimia dari eluates akhir. Dengan demikian, residu-residu yang dihasilkan dari hal tersebut secara signifikan mengurangi sensitivitas dan efisiensi reaksi enzimatik downstream.
Seiring dengan Identifikasi kontaminan kimia umum, membedakan berbagai jenis asam nukleat merupakan hal penting saat menilai kemurnian sampel. Salah satunya, sejumlah besar RNA yang tidak diinginkan dalam sampel templat DNA dapat mengakibatkan perkiraan konsentrasi DNA yang terlalu tinggi dan mengurangi hasil pengujian PCR downstream.
Kemurnian asam nukleat
Menilai kemurnian sampel asam nukleat, membantu membuat keputusan yang tepat mengenai apakah sampel tersebut dapat diproses, dibuang dari alur kerja atau diproses ulang sebelum analisis lebih lanjut.
Dampak pemurnian pada tahap downstream
Kemurnian sampel tentunya sangat berpengaruh pada keberhasilan analisis downstream. Bahkan, kehadiran inhibitor dan protein dalam asam nukleat murni dapat menghambat reaksi enzimatik, seperti digesti enzimatik oleh enzim restriksi, PCR, ligase, dan reaksi kimia uji kolorimetri.
Selanjutnya, DNA genom residual dalam sampel RNA dapat memengaruhi nilai CT hasil qPCR. Konsentrasi RNA dalam jumlah besar pada sampel DNA mengakibatkan khelasi Mg2+ yang akan mengurangi hasil PCR.
Teknologi untuk menilai kemurnian
Pengukuran spektrofotmetri UV memungkinkan penghitungan konsentrasi asam nukleat berdasarkan absorbansi sampel pada 260 nm. Absorbansi 280 nm dan 230 nm dapat digunakan untuk menilai tingkat kontaminasi protein atau bahan kimia masing-masing.
Rasio absorbansi asam nukleat terhadap kontaminan memberikan perkiraan kemurnian sampel dan dapat digunakan sebagai kriteria penerimaan untuk memasukkan atau mengecualikan sampel dalam aplikasi downstream.
Kelemahan
Kelemahan dari metode ini, spektrofotometer klasik tidak dapat membedakan jenis asam nukleat. Untuk itu, perhitungan penentuan konsentrasi hanya bergantung pada absorbansi 260 nm.
Kedua molekul DNA dan RNA, yang terdapat dalam sampel akan berkontribusi pada nilai absorbansi. Akan tetapi, metode tersebut sebenarnya digunakan untuk mengukur seluruh asam nukleat dalam sampel dan mengakibatkan perkiraan konsentrasi RNA atau DNA terlalu tinggi.
Selanjutnya, rasio A260/A230 dapat merugikan ketika molekul penyerap UV lainnya berada dalam buffer elusi. Pengukuran sampel kosong dan mengurangi background untuk mencegah molekul-molekul tersebut mengganggu pembacaan daya serap, namun kehadirannya dalam sampel masih memengaruhi aplikasi downstream.
Oleh karena itu, penggunaan metode fluoresen dapat membantu mengukur molekul yang diinginkan. Sayangnya, metode tersebut tidak dapat memberikan informasi mengenai kontaminasi.
Reference
