Prosedur kompleks multistep yang menggabungkan PCR dan reaksi enzimatik untuk menyiapkan fragmen DNA dengan konsentrasi, kemurnian, dan panjang tertentu yang kompatibel pada platform sekuensing tertentu disebut alur kerja NGS. Dengan demikian, kualitas sampel perlu ditelusuri kemudian dipertahankan sepanjang alur kerja untuk memastikan bahwa hanya sampel dengan kualitas yang sesuai diproses ke dalam rangkaian sekuensing sehingga membutuhkan NGS library.
Hal ini dikarenakan, menemukan masalah pada sampel dengan melihat hasil akhir bukanlah langkah yang tepat atau sudah terlambat. Sebab, kualitas NGS library merupakan faktor paling berpengaruh pada keberhasilan proses sekuensing dengan memengaruhi validitas urutan dan jumlah pembacaan (reads).
Tak hanya itu, prosedur QC melacak keberhasilan langkah persiapan library, untuk memastikan hanya sampel berkualitas baik yang akan diproses pada tahap downstream. Selanjutnya, diurutkan agar menghasilkan pembacaan dengan kualitas terbaik yang dapat diubah menjadi interpretasi bermakna dengan tingkat kepercayaan tinggi.
Berikutnya, setelah pengurutan serta analisis varian, hasil yang didapatkan perlu diverifikasi dan divalidasi menggunakan teknologi selain NGS, seperti pyrosequencing. Berikut langkah kerja NGS.
Langkah 1: Persiapan sampel
Eksperimen sekuensing akan berhasil dengan menggunakan pemurnian asam nukleat berkualitas tinggi. Walaupun, metode ekstraksi asam nukleat otomatis memberikan throughput, reproducibility serta hasil yang tinggi namun tetap disarankan untuk melakukan pemeriksaan QC.
Pemeriksaan QC yang perlu dilakukan ialah kuatitas, kemurnian, juga integritas sampel sebelum diproses. Bahan awal untuk konstruksi NGS library, yakni berupa semua jenis asam nukleat yang dapat diubah menjadi DNA untai ganda (dsDNA). Di samping itu, seringkali gDNA, amplikon PCR, sampel ChIP (chromatin immunoprecipitation), dan RNA harus memiliki kemurnian, integritas tinggi, dan konsentrasi yang cukup untuk reaksi sekuensing.
Perlu diketahui pula, jika beberapa kontaminan, seperti RNA, protein atau bahan kimia dapat mengganggu persiapa library dan reaksi sekuensing. Begitupun, saat melakukan sekuensing DNA langkah penghapusan RNA sangat disarankan, kemudian sebaliknya pada sekuensing RNA, penghapusan gDNA (genomic DNA) juga disarankan.
Lalu, kemurnian sampel dapat dinilai selepas ekstraksi asam nukleat dan pada alur kerja persiapan library menggunakan spektrofotometri UV/Vis. Sementara itu, untuk sampel DNA dan RNA kelimpahan relatif protein dalam sampel yang dapat dinilai dengan menentukan rasio A260/A280, akan tetapi seharusnya antara 1,8 – 2,0.
Kontaminasi senyawa organik dapat dinilai dengan menggunakan rasio A260/A230, meskipun rasio seharusnya >2,0 untuk DNA dan >1,5 untuk RNA. Bahkan,spektrofotometri generasi berikutnya dengan sistem QIAxpert. Hal itu, memungkinkan pembuatan spectral content profiling, yang dapat membedakan DNA dan RNA dari kontaminan sampel tanpa menggunakan pewarna.
Langkah 2: Target enrichment dan persiapan NGS library
Setelah melakukan pemurnian, asam nukleat perlu diproses melalui alur kerja persiapan NGS library. Hal ini disebabkan untuk memenuhi persyaratan platform sekuensing yang berhubungan dengan ukuran, kemurnian, konsentrasi, dan ligasi adapter efisien (informasi selengkapnya mengenai persiapan library di QIAseq portfolio ).
Pada tahapan ini, langkah pertama yang perlu dilakukan, yaitu memotong asam nukleat menjadi fragmen lebih kecil dengan metode pemotongan fisik atau enzimatik. Distribusi ukuran tertentu dari sampel dicukur diperlukan agar sekuensing berhasil.
Karena itu, platform NGS dioptimalkan untuk sekuensing fragmen dalam rentang ukuran tertentu. Fragmen yang terlalu panjang atau pendek akan kurang optimal untuk reaksi sekuensing.
Amplifikasi PCR spesifik dari wilayah yang diminati untuk meningkatkan kedalaman sekuensing wilayah ini dapat dijalani library. Tak hanya itu, library yang disiapkan tanpa prosedur pengayaan mengurangi bias persiapan library tetapi lebih menantang untuk menilai QC.
Kedalaman pengurutan area, misalnya wilayah kaya GC, promotor, dan wilayah berulang ditingkatkan sehingga deteksi dan penemian varian urutan baru meningkat.
Setelah itu, langkah pemilihan ukuran menghilangkan seluruh kontaminan, contohnya unligated adapter dan primer-dinner serta fragmen yang terlalu pendek atau panjang. Pendistribusian ukuran dan pengukuran konsentrasi menggunakan sistem elektroforesis kapiler, seperti QIAxcel Advanced. Hal ini, merupakan langkah QC terakhir terakhir sebelum menjalankan pengurutan untuk memastikan library telah diamplifikasi dan dimurnikan dengan benar.
Langkah 3: validasi
Langkah terakhir dalam alur kerja ini, yaitu memverifikasi hasil sekuensing kemudian divalidasi menggunakan teknologi sekuensing alternatif, pyrosequencing. Penggunaan teknologi alternatif adalah untuk menghindari risiko varian positif palsu dalam alur kerja NGS.
Untuk mempelajari WGS menggunakan NGS dapat dibaca lebih lanjut di sini.
Pun, pembahasan mengenai pemanfaatan WGS dalam genomic surveilance dapat dibaca juga di sini.
