Artikel
Oktober 12, 2021 - Posted by

Penelitian proteomik bottom-up untuk mengidentifikasi dan mengukur proteom lengkap dalam sel, jaringan, atau organisme. Kedalaman profil proteom meningkatkan pengetahuan mengenai proses fisiologis yang kompleks dan pengaruhnya terhadap fenotipe.

Kedua hal tersebut, berpotensi untuk mengarahkan kemajuan di pelbagai bidang, di antaranya penemuan biomarker dan pengobatan presisi yang meningkat.  Keragaman mengenai rentang dinamis protein ditemukan dalam biofluida, misalnya plasma manusia atau sel memerlukan alat dengan pengukuran yang kuat dan sensitivitas serta spesifitas tinggi,.

Pembuatan profil proetom dengan metode berbasis nano-LC menggunakan kolom panjang dan gradien dangkal. Lalu, gradien tersebut digabungkan dengan High Resolution Masss Spectrometers untuk karakterisasi dan identifikasi peptida dan protein sebanyak mungkin.

20 tahun terakhir, terlihat inovasi signifikan instrumentasi LC-MS untuk pemisahan dan deteksi peptida dalam kekuatan alat analisis dan digest. Hal ini bertujuan, untuk menganalisis kumpulan daya yang semakin kompleks.

Salah satu, metrik kunci untuk mengukur kinerja dalam kromatografi gradien adalah kapasitas puncak atau jumlah maksimum teoritis dari puncak yang dapat diselesaikan sepenuhnya saat pemisahan. Pada kapasitas puncak lebih tinggi, lebih banyak peptida yang diselesaikan secara kromatografi dengan mengarah peningkatan sensitivitas untuk peptida tingkat rendah dan menjadi lebih banyak identifikasi.

Sistem vanquish neo UHPLC untuk proteomik

Kapasitas puncak sebanding dengan akar kuadrat dari panjang kolom. Umumnya, hal ini kerap terjadi pada kromatografi cair fase terbalik. Pun, peningkatan puncak membutuhkan partikel yang lebih kecil atau kolom lebih panjang sehingga dapat meningkatkan tekanan instrumen nano-LC.

Gradien yang lebih panjang (dangkal) telah terbukti pula dapat meningkatkan kapasitas puncak peptida dalam pemisahan kromatografi fase terbalik. Selanjutnya, alur kerja proteomik klasik menggunakan kolom ID 75 µm yang dikemas dengan partikel 2 µm yang dioperasikan pada laju alir dari 200 hingga 500 nL/menit.

Kondisi itu, mengakibatkan penggunaan kolom yang lebih panjang dari 50 cm sehingga sangat membatasi keluaran sampel (dalam beberapa kasus hanya beberapa sampel/hari). Langkah pencucian dan ekuilibrasi yang bersamaan, kemudian adapun system dead volume kian membatasi throughput sampel dan pemanfaatan MS.

 

Sementara itu, penurunan diameter kolom dapat menyebabkan peningkatan sensitivitas metode. Kontributor utama peningkatan sensitivitas laju alir nano serta kapiler, yaitu hubungan terbalik antara laju alir dan efisiensi ionisasi elektrospray IESI).

Di sisi lain, laju alir yang lebih rendah mampu meningkatkan pengambilan sampel analir oleh spektrometer massa dan mengurangi penekanan ionisasi oleh komponen matriks. Dengan demikian, upaya mengurangi waktu analisis overhead perlu difokuskan pada peningkatan kecepatan pemuatan sampel dan keseimbangan kolom.

Selaras dengan itu, laju air rendah perlu dipertahankan selama pemisahan sampel dan langkah akuisisi data MS. Berikutnya, upaya untuk menjaga volume penundaan gradien seminimal mungkin menggunakan desain sistem nano-LC volume rendah.

Hal tersebut, dilakukan secara bersamaan dengan konfigurasi fluidic yang dioptimalkan agar dapat memaksimalisasi throughput analisis dan pemanfaatan MS dalam analisis nano-LCMS. Atribut penting lainnya, dalam alur kerja proteomik adalah reproduktifitas kolom ke kolom.

Meskipun kapasitas puncak tinggi, pembuatan profil proteom dalam tanpa pemisahan dapat direproduksi di beberapa kolom. Oleh sebab itu, hal ini akan sulit untuk menarik kesimpulan yang andal.

Kemajuan terbaru nano-LCMS menggunakan sistem Vanquish Neo UHPLC yang digabungkan dengan spektrometer massa Orbitrap Exploris 480 untuk pembuatan profil proteome dalam pencernaan protein sel HeLa. Kemampuan tekanan yang diperluas, Vanquish Neo dapat menghasilkan pemisahan yang sangat reproducible dari ID 75 µm x 50 cm dan ID 75 µm x 75 cm.

Kolom PepMap Neo dapat meningkatkan kapasitas puncak dan membuka pintu untuk menjalankan kolom pemisahan lebih lama. Hal ini dapat mencapai kinerja pemisahan yang lebih baik. Pemuatan sampel dan ekuilibrasi yang cepat melalui tingkatan tekanan 1500 bar pada sistem UHPLC.

Bahan habis pakai menghasilkan throughput metode yang lebih baik dan peningkatan pemanfaatan MS. Di samping itu, prosedur pencucian jarum tingkat lanjut meminimalisasi sisa sistem tanpa membuang waktu siklus kerja MS.

Penggunaan metode gradien 4 jam dapat mengidentifikasi 80.000 peptida dan lebih dari 7.000 protein dalam eksperimen nano LCMS single-shot melalui mode data-depent acquisition (DDA). Lebih dari 80% pemanfaatan MS, digunakan untuk alur kerja injeksi sampel yang tercapai.

Reference

thermofisher.com

 

Our Location

HEAD QUARTERS - JAKARTA

  • Kebon Jeruk Business Park Blok F2-9, Jl. Raya Meruya Ilir No.88, Meruya Utara, Jakarta Barat - 11620

CIKARANG OFFICE

  • CBD Jababeka Blok A-8 Jl. Niaga Raya Kav. AA3, Jababeka II Pasar Sari

SURABAYA OFFICE

  • Gedung Bumi Mandiri Tower I, Lantai 4/410 Jl. Basuki Rahmat 129-137, Surabaya 60271

MEDAN OFFICE

  • Regus Forum Nine, 9th Floor Jl. Imam Bonjol No 9, Medan 20112

Get In Touch with Us

  • This field is for validation purposes and should be left unchanged.