Aplikasi PCR terbukti dapat membantu peneliti dalam penelitian analisis DNA sejak pertama kali ditemukan oleh Kary Bank Mulis pada tahun 1983. Hal ini, selaras dengan kehadiran teknologi generasi ketiga dalam PCR, yaitu digital PCR.
Digital PCR membawa kemajuan dalam teknik analisis dan menjawab kebutuhan dalam berbagai tantangan yang dihadapi peneliti. Tak hanya itu, digital PCR memiliki sejumlah keunggulan dibandingkan dua generasi terdahulunya. Berikut aplikasi pcr untuk deteksi biomolekular menggunakan QIAcuity Digital PCR dari QIAGEN.
A. Deteksi Halal
A. Deteksi HalalPemalsuan makanan atau kesalahan pelabelan kerap terjadi di industri pangan. Hal ini dikarenakan, jika industri pangan tidak dilakukan dengan benar maka dapat menyebabkan pelbagai permasalahan pada keamanan makanan, kontaminasi, dan batasan agama, misalnya dalam muslim, babi dan hindu, sapi.
Di bawah ini terdapat metode yang dapat digunakan untuk mendeteksi daging beserta keterbatasannya.
- Kromatografi, imunologi, elektroforesis, akurasi terbatas, tingkat sensitivitas rendah, membutuhkan waktu yang lama, dan tidak dapat deteksi untuk daging yang telah dimasak.
- PCR konvensional, keterbatasan hanya dapat mendeteksi DNA secara kualitatif.
- Real-Time PCR sensitivitas terbatas, perhitungan kuantitatif berdasarkan pada kurva standar yang memungkinkan terjadinya perbedaan efesiensi amplifikasi, sensitif terhadap inhibitor, dan membutuhkan waktu yang lama dan biaya yang cukup besar.
Berdasarkan hal tersebut, kerap ditemukan hambatan yang sering dihadapi saat pengujian dan pemalsuan daging.
- Produk makanan yang telah diproses mengandung banyak bahan lain, contohnya pengawet dan daging lain (selain target yang dituju, seperti daging babi).
- Pemurnian yang dilakukan pada saat ekstraksi asam nukleat, memungkinkan untuk mengganggu efesiensi proses PCR sehingga menyebabkan hasil amplifikasi tidak baik dan tingkat sensitivitas rendah.
- Hasil representasi dari amplifikasi sampel sering berbeda dengan standar dikarenakan adanya perbedaan efesiensi amplifikasi.
Dengan demikian, digital PCR lebih baik digunakan untuk pengujian pemalsuaan daging dengan beberapa keuntungan seperti berikut.
- Kuantifikasi absolut, tidak membutuhkan kurva standar
- Tingkat partisi sampling tinggi
- Sangat akurat dan presisi bahkan pada target yang jumlah copy DNA nya rendah
- Dapat mendeteksi rare target
- Resisten terhadap inhibitor
- Biaya yang digunakan tidak besar terutama untuk multiplexing
B. Kadar GMO
Bidang agrikultur acap kali menggunakan organisme transgenik, terutama untuk meningkatkan hasil pertanian, pengurangan biaya pakan, mengurangi pestisida, dan meningkatkan kandungan nutrisi. Karena itu, terdapat banyak negara yang mengatur ambang batas GMO.
Salah satunya, European Union (EU) Regulation (EC) 1829/2003. EU menentukan ambang batas kadar GMO produk pangan ialah 0.9%, kemudian pada pakan hewan sebesar 0.1%. Lalu, tidak adanya toleransi untuk GMO yang melebihi ambang batas.
Regulasi GMO bersifat krusial sehingga diperlukannya metode sensitif dan akurat untuk deteksi serta perhitungan GMO agar dapat memberikan lable produk GMO secara tepat.
Berikut metode deteksi GMO yang telah digunakan.
- Pengujian berdasarkan Protein
– Enzyme-Linked Immunoasorbent Assay (ELISA)
– Lateral Flow Device (LFD)
- Pengujian berdasarkan DNA
– Deteksi Real-Time PCR
– Next Generation Sequencing (WGS atau Targeted Sequencing)
Akan tetapi, metode di atas memiliki kekurangan, di antaranya.
- Pengembangan antibodi mahal dan membutuhkan waktu lebih lama.
- Variasi pada kandungan protein bisa terjadi di setiap sel dan jaringan.
- Keterbatasan metode berbasis protein untuk pengujian semua sampel GMO.
- Protein cenderung lebih banyak rusak daripada DNA pada sampel yang telah mengalami proses sebelumnya.
- Sensitivitas pada pengujian GMO dengan realtime PCR terbatas.
- Sensitif terhadap inhibitor.
- Biaya dan analisis yang dilakukan pada metode NGS cukup kompleks.
Alasan aplikasi PCR digunakan untuk pengujian GMO
- Kuantifikasi absolut, tidak membutuhkan kurva standar
- Tingkat partisi sampling tinggi
- Sangat akurat dan presisi bahkan pada target yang jumlah copy DNA nya rendah
- Dapat mendeteksi rare target
- Resisten terhadap inhibitor
- Biaya yang digunakan tidak besar terutama untuk multiplexing
Hal ini memungkinkan pendekatan multipleks non-diskriminatif dengan dua reporter yang dapat sangat mengurangi biaya pengujian GMO.
- Channel 1: referensi spesies target
- Channel 2: multipleks untuk semua target GMO pada spesies tersebut
C. Copy Number Variation
Copy Number Variation (CNV) merupakan variabilitas pada segmen DNA di genom akibat adanya duplikasi atau delesi. Rentang Panjang variasi segmen DNA ini, pada genome bervariasi mulai 50bp hingga mega base pair. CNV dapat dikategorikan menjadi short repeats (long repeats) dan rare (<1%) atau berulang (>1%) CNV.
CNV juga, memiliki hubungan dengan berbagai macam penyakit umum serta kompleks.
Sehubungan dengan itu, digital PCR hadir untuk mengatasi masalah heterogenitas sampel dalam deteksi CNV, antara lain.
- Kuantifikasi jumlah copy DNA secara absolut.
- Presisi dan sensitivitas tinggi.
- Limit of detection (LoD) berdasarkan pada DNA input.
- High-throughput untuk validasi mutase yang telah diketahui validation of known mutations.
- Pengujian NGS untuk mengetahui mutasi baru.
D. Deteksi Mutasi
Mutasi adalah istilah kolektif untuk menyebut perubahan permanen yang terjadi pada sekuen genom manusia. Fakta mengenai mutasi, yakni.
- Mutasi Dapat disebabkan oleh kesalahan replikasi DNA, paparan bahan kimia, radiasi, atau infeksi virus
- Penghapusan, substitusi, inversi, translokasi, duplikasi, penyisipan wilayah genom
- Dimulai dari perubahan pada pasangan basa tunggal atau gen tunggal hingga segmen kromosom
- Dapat dikategorikan sebagai keturunan atau de novo, autosomal atau terkait-X/Y, dan sering atau jarang.
- Marker untuk polimorfisme – warna rambut dan mata, golongan darah, sidik jari, dan lainnya.
- Terkait dengan penyakit dan sifat umum dan kompleks
Tantangan yang dihadapi dalam deteksi mutasi sebagai berikut.
- Kualitas sampel yang sangat bervariasi
- Jumlah sampel terbatas
- Ekstraksi DNA sampel yang tidak optimal
Di bawah ini merupakan kelebihan digital PCR dalam membantu deteksi mutasi, jika dibandingkan dengan metode lain.
- Kuantifikasi absolut dari salinan tipe bermutasi vs. wild type
- PCR digital menunjukkan presisi dan sensitivitas yang luar biasa
- Batas deteksi berdasarkan input DNA
- Validasi mutasi dengan throughput tinggi
- Pengujian ulang hasil NGS untuk validasi mutasi baru
Kehadiran teknologi digital PCR melalui instrument QIAcuity, diyakini dapat memenuhi berbagai kebutuhan penelitian yang semakin kompleks dan menantang. Untuk mengetahui dan berkonsultasi mengenai aplikasi lain yang dapat dikerjakan dengan QIAcuity sila menghubungi kami di sales@genecraftlabs.com
References
