Kemajuan teknologi pada masa sekarang juga berdampak pada bidang bioteknologi terutama dalam metode PCR. Digital PCR (dPCR) adalah metode terbaru dari teknologi PCR. Prinsip digital PCR secara umum adalah membagi satu reaksi PCR menjadi banyak partisi dengan satuan ukuran nanofluidics. Karenanya, menghasilkan hasil perhitungan jumlah amplifikasi DNA target menjadi lebih sensitif, spesifik dan akurat. Dengan Teknik ini, absolute quantification copy number DNA dapat dihitung dengan presisi, bahkan pada DNA dengan low copy numbers. dPCR telah banyak digunakan untuk deteksi maupun penelitian, seperti Copy number variation (CNV), Genetics Modified Organism (GMO), ekspresi gen, pengujian halal, dan lain sebagainya. Untuk beberapa aplikasi tersebut, dapat dilakukan hanya dengan menggunakan duplex PCR digital.
Duplex dPCR merupakan digital PCR yang mampu mendeteksi dua fluorescent untuk mendeteksi dua gen target. Pada artikel ini akan dibahas beberapa aplikasi duplex PCR pada digital PCR.
Duplex PCR Digital untuk Copy Number Variation (CNV)
Copy number variation (CNV) merupakan bagian penting pada keanekaragaman genomik sebagai single nucleotide polymorphism (SNP). Redon et al. (2006) mendefinisikan CNV adalah segmen DNA satu kilobase (kb) atau lebih besar apabila dibandingkan dengan copy number referensi genom.
Beberapa CNV ini, tidak memiliki pengaruh yang jelas terhadap fenotipe, namun adanya CNV ini banyak dikaitkan dengan tejadinya penyakit pada manusia. Penelitian lain juga menunjukkan, bahwa adanya CNV merupakan hasil dari interaksi faktor genetik dan lingkungan sehingga, menyebabkan terjadinya perubahan fenotipe.
Skala besar variasi struktural karena CNV akibat dari adanya duplikasi pada genom manusia berhubungan dengan beberapa penyakit. Metode yang sering digunakan untuk deteksi CNV, di antaranya array comparative genomic hybridization (aCGH) panels dan SNP microarray.
Akan tetapi, metode ini sulit untuk deteksi duplikasi atau dalam deteksi peningkatan terjadinya copy number. Metode dPCR dapat digunakan dapat secara tepat untuk mendeteksi CNV dalam genom.
Spinal muscular atrophy (SMA) adalah salah satu penyakit genetic utama yang menyebabkan banyak kematian bayi di dunia. Penyakit yang ditandai dengan hilangnya motoric neuron tulang belakang karena adanya autosomal neurodegenerative dini.
Terjadinya dikarenakan hasil dari kehilangan atau mutasi gen survival motor neuron 1 (SMN1) pada chromosom 5q13. Pada manusia, large tandem duplikasi kromosom dapat menghasilkan gen SMN2. SMN1 dan SMN2 ini dapat dipisahkan berdasarkan perbedaan satu nukleotida pada outset exon 7 yang mengganggu terjadinya exonic splice enhancer.
Apabila kebanyakan dari SMN2 mRNA memiliki sedikit exon 7 diproduksi, maka dapat menyebabkan SMN1 banyak mengalami kehilangan gen penyusun, sehingga berdampak pada peningkatan terjadinya penyakit SMA.
Berdasarkan penelitian Stabley et al (2016) dengan menggunakan metode duplex PCR digital mampu medeteksi jumlah copy number gen survival motor region neuron 1(SMN1) dan survival motor region neuron 2 (SMN2) secara akurat.
Metode ini dapat membedakan jumlah copy number antara SMN1 dan SMN 2 (berkisar antara 0 hingga 5 copies). Lalu, metode lain, seperti qPCR dan QCEFA hanya dapat membedakan antara 0 hingga 4 copies.
Duplex PCR Digital untuk Genetics Modified Organism (GMO)
Jumlah organisme yang sudah dimodifikasi secara genetika pada masa sekarang semakin meningkat, terutama pada spesies tumbuhan yang dikomersialisasikan. Deteksi GMO berdasarkan pada pengujian DNA dan quantifikasi biasanya menggunakan kuantitatif real-time PCR (qPCR).
Reaksi qPCR sensitif terhadap inhibitor dan membutuhkan kurva standar untuk quantifikasi. Hal ini menyebabkan, sulitnya untuk mendeteksi GMO pada kompleks matrix.
Kedelai varietas MON40-3-2 adalah salah satu varietas yang paling banyak digunakan untuk bahan baku produk komersial. Varietas ini dikenal dengan “Roundup Ready”.
Sebelumnya, metode real-time PCR digunakan untuk mendeteksi varietas ini yang mengalami kesulitan. Hal ini dikarenakan, hasil menunjukkan adanya inhibitor pada reaksi PCR sehingga sulit untuk melakukan kuantitas DNA hasil amplifikasi.
Metode dPCR membagi reaksi menjadi individual reaksi yang disebut dengan partisi lebih sensitif dan toleran terhadap inhibitor. Penelitian yang dilakukan oleh Košir et al (2019) menggunakan duplex PCR dimana gen yang menjadi target adalah lectin gene (Le1) dan gen target pada varietas MON40-3-2.
Kedua gen tadi berhasil melakukan kuantifikasi gen pada varietas MON40-3-2 melalui kompleks sampel yang terdahulunya tidak bisa dilakukan dengan metode qPCR.
Hasil penelitian ini, merupakan peningkatan untuk melakukan GMO testing dan dapat mentransfer metode qPCR ke metode dPCR.
Duplex PCR Digital untuk Ekspresi Gen
Ekspresi gen ialah fundamental proses kehidupan yang menjadi pengantar informasi antara gen pengkode dan gen fungsional produk akhir, seperti protein atau non-coding (ncRNA). Kemampuan untuk melakukan analis gen ekspresi secara kuantitatif sangat penting dilakukan.
Hal ini berpengaruh, terhadap metode yang presisi untuk menghitung level gen yang terekspresikan pada sejumlah sel, jaringan atau keseluruhan gen (Volgin, 2014).
Digital PCR menjadi teknik yang dapat diandalkan untuk kuantifikasi ekspresi gen, karena dengan menggunakan ini dapat meningkatkan sensitivitas, dan repduksibilitas dibandingkan dengan real-time quantitative PCR (qPCR). Keuntungan metode ini relevan untuk low-abundant target.
Dalam melakukan analisis kuantitatif ekspresi gen, dapat dilakukan dengan membandingkan gen target dengan gen referensi. Kuantitatif ekspresi gen sangat dibutuhkan pada bidang imunoterapi, karena dengan mengetahui jumlah copy number gen yang terekspresikan dapat diketahui keberhasilan dari imunoterapi tersebut.
Berdasarkan hasil penelitian Schubert et al (2021) dengan menggunakan duplex PCR digital dapat menghitung jumlah gen yang terekspresikan pada darah pasien kanker ganas lymphoid yang telah diterapi. Hal ini menggunakan sel terapi Chimeric antigen receptor (CAR) T.
Hasil dari penelitian ini sangat berguna untuk menentukan cara perawatan dan terapi pasien yang terdiagnosis kanker ganas lymphoid. Selain itu, duplex PCR digital juga berhasil dimanfaatkan untuk kuantifikasi dan karakterisasi Adeno-associated virus (AAV) yang biasa nya digunakan sebagai vektor untuk gen terapi.
Berdasarkan hasil penelitian Carver et al. (2021), dengan menggunakan duplex dPCR QIAcuity dapat menghitung copy number AAV pada sampel. Hasil dPCR QIAcuity menunjukkan reproduksibilitas yang lebih baik dari sistem qPCR.
Duplex PCR Digital untuk Pengujian Halal
Pengujian halal dilakukan untuk mendeteksi adanya kandungan atau cemaran porcine pada suatu produk. dPCR untuk deteksi halal menunjukkan hasil yang spesifik, sensitive, akurat dan reproduksibilitas serta hasil yang mudah untuk diinterpretasikan.
Hasil yang didapatkan biasanya berasal dari gen target dan internal control. Oleh karena itu dengan menggunakan duplex dPCR uji halal ini sudah bisa dilakukan.
Penelitian yang dilakukan oleh Cai et al. (2017) Dengan menggunakan duplex dPCR berhasil mendeteksi adanya cemaran babi pada produk daging sapi. Sistem dPCR dapat mendeteksi 0,1 ng/µl. Selain itu penelitian yang dilakukan oleh Temisa et al. (2020) dengan menggunakan sampel dari high processed meat product system duplex dPCR mampu mendeteksi jumlah copy number pada sampel yang menggandung dan tercemar dengan DNA babi.
Hal ini dikarenakan sistem dPCR sangat sensitif, spesifik dan akurat. Selain dari beberapa paparan aplikasi duplex dPCR yang telah dijelaskan, masih banyak lagi aplikasi lainnya yang dapat dilakukan dengan menggunakan dPCR.
Untuk informasi lebih lanjut dan kebutuhan penelitian mengenai duplex PCR digital serta kebutuhan peralatan lab lainnya, dapat langsung menghubungi kami di sales@genecraftlabs.com
References
